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室溫AA固定液對組織冰凍切片效果最佳
發布時間:2020-09-03

  摘    要: 目的 探討固定液溫度對冰凍切片質量的影響。方法 選取南方醫科大學南方醫院冰凍新鮮肺組織20例、乳腺組織20例、腸組織20例、甲狀腺組織20例和腦組織20例,每個病例取一塊組織,每塊組織連續切片4片,分成A組、B組、C組、D組,每組100片。A組采用室溫AA固定液中固定1 min;B組采用低溫恒冷AA固定液中固定1 min;C組采用低溫恒冷AA固定液中固定1 min,然后熱風固定10 s;D組采用低溫恒冷固定液中固定15 min;常規蘇木精-伊紅染色法(HE染色)進行HE切片染色,觀察四組的細胞形態差異、細胞核和胞漿的染色效果。結果 A、C組冰凍切片組織細胞輕微收縮, HE染色均勻,細胞核染色深藍色,核漿對比度較好;B組冰凍切片細胞輕微腫脹,切面易發生裂隙, HE染色不均勻,細胞核染色灰白灰藍色,核漿對比度較差;D組冰凍切片組織細胞局部輕微腫脹, HE染色局部不均勻,細胞核染色深藍色或灰藍色,核漿對比度較差。A組固定液染色綜合評分為(93.99±0.69)分, B組固定液染色綜合評分為(85.95±1.16)分, C組固定液染色綜合評分為(93.61±0.62)分,D組固定液染色綜合評分為(91.85±0.57)分,四組固定液染色綜合評分比較,差異有統計學意義(P<0.05)。結論 組織冰凍切片經室溫AA固定液固定后,細胞形態自然, HE染色細胞核染色鮮艷,核漿對比度較好。

  關鍵詞: 組織冰凍切片; AA固定液; 室溫固定; 低溫恒冷固定;

  Abstract: Objective To discuss the effect of fixation fluid temperature on the quality of frozen sections. Methods 20 cases of frozen fresh lung tissue, 20 cases of breast tissue, 20 cases of intestinal tissue, 20 cases of liver tissue, 20 cases of thyroid tissue and 20 cases of brain tissue in Nanfang Hospital of Southern Medical University were selected. 1 piece of tissue was taken from each case, and each piece of tissue was cut into 4 pieces, which were divided into group A, group B, group C and group D, with 100 pieces in each group. Group A was fixed in room temperature AA fixation fluid for 1 min. Group B was fixed in low temperature and constant cooling AA fixation fluid for 1 min. Group C was fixed in low temperature and constant cold AA fixation fluid for 1 min, followed by hot air fixation for 10 s. Group D was fixed in low temperature and constant cooling fixation fluid for 15 min. Hematoxylin eosin staining(HE staining) was used to observe the cell morphology, nuclear and cytoplasmic staining effect of the four groups. Results In group A and C, the frozen section cells contracted slightly, the HE staining was evenly, the nuclear staining was dark blue, and the contrast of nuclear plasma was good. In group B, the cells in frozen section were slightly swollen, the section was easy to crack, the HE staining was uneven, the nucleus staining was gray and gray blue, and the nucleocytoplasmic contrast was poor. In group D, the frozen section tissue cells were slightly swollen, the HE staining was uneven, and the nuclear staining was dark blue or gray blue, and the nucleocytoplasmic contrast was poor. The comprehensive score of fixation fluid staining of group A was(93.99±0.69) points, which was(85.95±1.16) points in group B,(93.61±0.62) points in group C and(91.85±0.57) points in group D. There was statistically significant difference in comprehensive score of fixation fluid staining among the four groups(P<0.05). Conclusion After frozen tissue sections are fixed with room temperature AA fixation fluid, the morphology of the cells is natural, the nucleus stain with HE is stained brightly, and the nucleocytoplasmic contrast is good.

  Keyword: Frozen tissue sections; AA fixation fluid; Room temperature fixation; Low temperature and constant cooling fixation;

  冰凍切片是借助低溫恒冷條件使組織迅速凍結達到一定硬度進行切片的一種方法,具有快速、方便的特點,而大范圍用于臨床手術中的快速病理診斷,因此做出高質量的冰凍切片是手術中確診病變性質、決定手術范圍的最重要的環節。一張好的冰凍HE切片主要取決于切片、固定和染色,這三方面環環相扣,相互影響。其中由于組織固定因素影響組織細胞形態的改變,染色效果不良,對結果的診斷影響最大,遠比其他操作因素引起的組織細胞形態改變更難把握[1]。因此,本實驗為提高冰凍切片染色效果,選擇室溫AA固定液和低溫恒冷AA固定液分別對組織冰凍切片快速固定,經HE染色后觀察其染色效果。
 

室溫AA固定液對組織冰凍切片效果最佳
 

  1 、材料與方法

  1.1 、材料

  選取南方醫科大學南方醫院2019年4~9月的冰凍新鮮肺組織20例、乳腺組織20例、腸組織20例、甲狀腺組織20例和腦組織20例。每例組織連續切片4片,分為A、B、C、D組,每組100片。

  1.2 、設備

  冷凍切片機,冰凍自動HE染色機。

  1.3 、主要試劑

  OCT冷凍包埋劑,AA液(由95%乙醇A∶乙酸A=99.75%∶0.25%組成),新鮮Harris蘇木素染液,0.3%鹽酸乙醇溶液,0.5%氨水溶液,0.5%水溶伊紅,75%乙醇,85%乙醇,95%乙醇,無水乙醇,二甲苯,中性樹膠。

  1.4 、取材及切片制作

  1.4.1、新鮮送檢組織取材大小約為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm,每個病例取一塊組織,每塊組織連續切片4張,分成4組,每組100張,切片厚度3~4μm。

  1。4。2 、HE切片的制作A組粘片后立即放入室溫(20~26℃)AA固定液中固定1 min;B組粘片后立即放入低溫恒冷AA固定液中固定1 min;C組粘片后立即放入低溫恒冷AA固定液中固定1 min,然后吹風筒低檔熱風加熱固定10 s;D組粘片后立即放入低溫恒冷AA固定液中固定15 min;固定后統一置于全自動染色機內進行HE染色。染色步驟如下:新鮮蘇木素染液染色3 min,自來水漂洗5 s,0。3%鹽酸乙醇溶液分化1s,自來水漂洗5 s,0。5%氨水溶液藍化5 s,自來水漂洗5 s,0。5%水溶伊紅染色10 s,自來水漂洗5 s,75%乙醇脫水5 s,85%乙醇脫水5 s,95%乙醇脫水5 s,無水乙醇Ⅰ脫水10 s,無水乙醇Ⅱ脫水10 s,二甲苯Ⅰ透明5 s,二甲苯Ⅱ透明5 s,中性樹膠封片。

  1.5 、染色效果及判定標準

  觀察各組切片染色后組織細胞形態;HE染色的均勻性、細胞核著色和核漿對比清晰度。染色效果在顯微鏡下依照《病理切片質量基本標準》[2]中“組織切片制備的基本要求”進行判定,由兩名高年資醫師對四組冰凍切片進行觀察,各自給出判定結果,若結果不一致邀請專家閱片或細化實驗,經協商后確定最終結果,采用雙盲打分。細胞核著色灰淡或過藍,減5分;紅(細胞質)與藍(細胞核)對比不清晰,減5分。

  1.6、 統計學方法

  采用SPSS22。0統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差表示,采用t檢驗,組間評分比較采用One-Way ANOVA檢驗。P<0。05表示差異具有統計學意義。

  2、 結果

  2.1 、組織細胞形態

  A和C組細胞輕微收縮;B組細胞輕微腫脹,切面易發生裂隙現象;D組局部組織細胞輕微腫脹;低溫恒冷固定后的組織細胞形態有差異,組織細胞形態改變以甲狀腺組織最明顯,不同固定方式導致的組織細胞形態差異。見表1。

  2.2 、組織細胞染色效果

  A、C組切片染色均勻,細胞核染色深藍色,細胞漿染色鮮艷,核漿對比度較好,綜合評分分別為(93。99±0。69)分和(93。61±0。62)分,HE染色見圖1和圖3;B組切片染色不均勻,細胞核染色灰藍灰白色,細胞漿染色較淡,核漿對比度較差,綜合評分為(85。95±1。16)分,HE染色見圖2。D組切片染色局部少許不均勻,細胞核染色深藍色或灰藍色,細胞漿染色局部較淡,核漿對比度一般,綜合評分為(91。85±0。57)分,HE染見圖4。A、B、C、D組組間固定液染色評分比較差異有統計學意義(P<0。05);經室溫固定的冰凍切片HE染色結果綜合評分更高,染色效果最佳。

  表1 四組細胞形態差異(n)
表1 四組細胞形態差異(n)

  圖1 A組冰凍切片染色效果(HE×10)
圖1 A組冰凍切片染色效果(HE×10)

  圖2 B組冰凍切片染色效果(HE×10)
圖2 B組冰凍切片染色效果(HE×10)

  圖3 C組冰凍切片染色效果(HE×10)
圖3 C組冰凍切片染色效果(HE×10)

  圖4 D組冰凍切片染色效果(HE×10)
圖4 D組冰凍切片染色效果(HE×10)

  3 、討論

  組織切片經過固定液能將蛋白質、酶、糖等沉淀或凝固成不溶性物質[3],保持組織細胞與正常生活時的形態相似。在AA固定液中,乙醇能迅速沉淀球蛋白和核蛋白。醋酸能沉淀核蛋白,穿透力強,且醋酸能使染色體的保存如同生活時一樣,并能將未分裂的細胞核染色質沉淀成為可以染色的塊狀體,故細胞核染色顯得清楚;同時,醋酸有使組織膨脹的作用[4],可以抵消乙醇所引起的組織收縮,能較好的保持組織學形態。

  在冰凍切片制片過程中,規定20~25 min內完成制片[5],所以固定方法非常重要。常見固定方法有室溫固定和低溫恒冷固定。冰凍切片在室溫(20~26℃)環境下固定,由于溫度遠高于低溫恒冷切片機內,固定液分子擴散較快,在有限的時間內組織細胞成分固定充分,HE染色均勻,細胞核染色深藍色,核漿對比度較好。冰凍切片于低溫恒冷切片機內固定,因冷凍切片機室內平均溫度-20℃,低溫環境下分子擴散速度慢,在有限的時間內組織細胞成分固定不充分,導致細胞腫脹明顯,HE染色不均勻,細胞核染色灰藍色,核漿對比度較差。在低溫恒冷條件下固定液內固定1 min后再用熱風加速固定10 s,染色效果明顯改善。在低溫恒冷條件下延長固定液的固定時間染色效果雖有改善,但局部仍然欠佳,染色效果仍不理想,而且固定太耗時間。通過實驗得出,固定液溫度對冰凍切片染色質量有影響;室溫固定冰凍切片染色效果最佳;如果固定液溫度低于切片溫度,冰凍切片置入低溫恒冷固定液內固定易觸發微冰晶效應,引起的組織細胞內液體的腫脹,導致核發生腫脹或核空泡,核染色差。低溫固定效應在體液豐富的組織切片中最突出,本次實驗中甲狀腺組織的冰凍切片最為明顯;同一切面病變組織較正常組織明顯。

  在實驗過程中還發現,各種人為操作也可以導致染色不均勻,例如冷凍包埋速度過慢產生的冰晶[6,7],切片時用力不均勻或切片時跳刀[8],切片后置于空氣中時間過長,還有冰凍組織因診斷需要重復切片而反復冷凍,都可發生染色不均勻現象。但只要工作認真負責是可以避免這些人為因素的發生,目前冰凍固定液種類繁多,其他固定液是否發生低溫固定效應還需進一步摸索。

  綜上所述,采用室溫AA固定液固定冰凍切片是一種較為滿意和實用的固定方式,組織形態自然,細胞核著色更藍,核漿對比度好,色彩更鮮艷。

  參考文獻

  [1]高美欽,黃雄飛,肖志蕓,等.不同固定液對冷凍切片HE染色影響的比.福建醫科大學學報,2001,35(4):367.
  [2]黃柳明.病理切片質量基本標準-組織切面完整的分析與啟示.中國當代醫藥,2009,16(14):197-200.
  [3]龔志錦,詹容洲.病理組織制片和染色技術.上海:科學技術出版社,1994:3.
  [4]董蕓蓉.不同固定液對甲狀腺冷凍切片固定效果的比較.臨床與實驗病理學雜志,2016,32(6):710-711.
  [5] 楊霞.常用冰凍固定液對冰凍制片效果的差異分析.養生保健指南,2018(7):238.
  [6]包翠芬,劉霞,穆長征,等.冰凍切片幾種防冰晶方法的比較.中國誤診學雜志,2006,6(17):3310-3311.
  [7]連愛瓊.快速冰凍切片技術在病理診斷中的應用分析.醫學理論與實踐,2016,29(16):2251-2252.
  [8]凌啟波,梁英杰.HE制片質控要求.臨床與實驗病理學雜志,2000,16(4):333-334.

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